دانش های مرتبط با زیست فناوری(بیوتکنولوژی)

طیف سنجی جذب اتمی (atomic absorption spectrophotometry)

طیف سنجی جذب اتمی در ازمایشگاه های بالینی به شکلی گسترده در اندازه گیری عنصرهای فی مانند الومینیوم ، کلسیوم ، مس ، سرب ، لیتیوم ، مگنزیوم ، روی ، و دیگر فها بکار میرود.

مقدمه 

بسیاری از اندازه گیری ها که در ازمایشگاه های بالینی انجام میشود بر مبنای اندازه گیری انرژی تابیده شده ، انرژی عبور کرده ، انرژی جذب شده ، انرژی پراکنده شده یا منعکس شده تحت شرایط کنترل شده صورت میگیرد. در این فصل به اصول چنین اندازه گیری هایی می پردازیم.

ماهیت نور 

تابش های الکترومغناطیس شامل انرژی های تابش شده است که طول موچ آنها از 10 nm  در مورد امواج کیهانی شروع میشود و به 1000 km برای امواج رادیویی میرسد. 

اصول تکنیک های پایه و ایمنی در آزمایشگاه 

برای آنالیز درست کمی و کیفی مایعات بدن و بافتها ، متخصصین آزمایشگاهی باید اصول پایه و تکنیکهای شیمی تحلیلی را درک کنند.عواملی که فرایند های تحلیلی و کاربری ها در آزمایشگاه بالینی را تحت تاثیر قرار میدهد شامل 1- مفهوم حلال و حل شونده 2- واحد اندازه گیری 3- مواد شیمیایی 4- مواد مرجع 5- تکنیک های پایه مانند نمونه برداری و توزیع های حجمی ، سانتریفوژ کردن ، اندازه گیری میزان رادیو اکتیویتی ، گران سنجی ، حرارت سنجی ، محلول بافر ، و پردازش محلول ها و 6- ایمنی 

مقدمه 

بسیاری از تصمیمات پزشکی متکی است بر تستهای آزمایشگاهی. پزشکان اغلب در جستجوی این هستند که 1- کدام تست (ها ) بیشتر اختصاصی هستند 2- و کم هزینه تر هستند 3- و یک مسیر درست و موثری را جهت تشخیص یا عملیات پزشکی فراهم میکنند.بهمین جهت در این جا ما به این مساله می پردازیم که چگونه از اطلاعات تشخیصی بدست آمده توسط یک تست استفاده کنیم و نیز تستهای تشخیصی مختلف را چگونه با یکدیگر مقایسه و ارزیابی کنیم.

مقدمه 

انتخاب متدهای تشخیصی جدید و یا اصلاح شده پدیده ای است که در ازمایشگاههای بالینی معمول است . انتخاب و ارزیابی متد دو گام کلیدی در پایه گذاری یک متد تشخیصی محسوب میشوند . و قبل از اینکه این متد ها مورد مصرف معمول قرار بگیرند می بایست به دقت انتخاب شوند و از نظر عملکردی کاملا بررسی شوند .هنگامی که قرار است یک متد جهت مصرف معمول ازمایشگاههای بالینی عرضه شود شاخص های متعددی باید مورد ارزیابی قرار گیرند 

فلورومتری (Fluorometry)

فلورسانس به وضعیتی گفته میشود که یک مولکول نور را در یک طول موج جذب کرده و در طول موجی بلندتر گسیل میکند.اتم یا مولکولی که فلورسانس میکند فلوروفور (fluorophore) نامیده میشود. فلورومتری به اندازه گیری نور فلوروسنت گسیل شده گفته میشود.آنالیز فلورومتری یک روش تحلیلی کمی است در علوم شیمیایی و زیستی و تکنیکی بسیار حساس و درست است.

طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش سوم

کالیبراسیون طول موج (wavelength calibration)

در دستگاه های با پهنای باند طیفی باریک ، یک شیشه ای از جنس هولمیوم اکساید (holmium oxide) در طیف 280 nm تا  650 nm اسکن میشود . این ماده قله های جذبی بسیار نوک تیزی در طول موجهایی معین از خود نشان میدهد و کاربر دستگاه میتواند طول موجهایی را که بیشترین جذب را تولید میکنند با مقدار های مشخص شده برای شیشه هولمیوم اکساید مقایسه کند.

طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش دوم

منبع های نور (light sources)

انواع منبع های نور که در طیف سنج ها استفاده میشود شامل لامپهای گدازشی (incandescent lamps) ، لامپهای تخلیه زنون (xenon discharge lamps) ، دیودهای تابنده نور (light emitting diods) ، و لیزر ها (lasers) می باشد.

لامپهای گدازشی (incandescent) ، جرقه ای (Arc) و کاتدی (cathode)

در این نوع منبع های نور برای اندازه گیری در بخش نور مریی یک طیف ، معمولا از نور تنگستن (tungsten) استفاده میشود.طول عمر رشته تنگستن در حضور فشار کمی از بخارهای ید یا برم در درون لامپ افزایش می یابد( در حدود 2000 تا 5000 ساعت ).

منبع نور تنگستن انرژی تابشی کافی برای اندازه گیری در محدوده فرابنفش (کمتر از 320 nm ) را نمی تواند تامین کند.

طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش اول

اسپکتروفتومتری (spectrophotometry) 

فوتومتری به عنوان اندازه گیری نور تعریف میشود و اسپکتروفوتومتری به عنوان اندازه گیری شدت نور در طول موجهای انتخابی تعریف میشود.انالیزهای اسپکتروفوتومتری بصورتهای کمی و کیفی بطور وسیع در علوم زیستی و شیمیایی استفاده میشود ، این متد وابسته به ویژگی های جذب نوری ماده یا مشتقات ماده مورد انالیز دارد.شدت نور عبوری که از یک محلول حاوی یک ماده جذب کننده نور ( رنگزا = chromogen) عبور میکند با کم شدن بخش جذب شده ، کاهش می یابد. این کسر در شدت نور ، تشخیص داده شده ، اندازه گیری شده و برای ارتباط دادن نور عبوری یا جذب شده با غلظت انالیت مورد نظر ارتباط داده میشود .

مقدمه 

بسیاری از اندازه گیری ها که در ازمایشگاه های بالینی انجام میشود بر مبنای اندازه گیری انرژی تابیده شده ، انرژی عبور کرده ، انرژی جذب شده ، انرژی پراکنده شده یا منعکس شده تحت شرایط کنترل شده صورت میگیرد. در این فصل به اصول چنین اندازه گیری هایی می پردازیم.

ماهیت نور 

تابش های الکترومغناطیس شامل انرژی های تابش شده است که طول موچ آنها از 10 nm  در مورد امواج کیهانی شروع میشود و به 1000 km برای امواج رادیویی میرسد. با این حال ما در این فصل وقتی در مورد واژه نور صحبت میکنیم شامل انرژی های تابیده شده در گستره فرابنفش تا نور مرئی(180 – 800 nm) است.

نفلومتری(nephelometry) و توربیدیمتری(turbidimetry)

پراکنش نور یک پدیده فیزیکی است که از برهم کنش نور با ذرات درون محلول ایجاد میشود.نفلومتری و توربیدیمتری روشهای آنالایتیکالی هستند که برای اندازه گیری نور پراکنده شده بکار برده میشوند.اندازه گیری پراکنش نور در ایمونواسی شماری از پروتیین ها و هاپتن هایی ویژه بکار رفته است.

کمی لومینسانس (chemiluminescence) ، بیولومینسانس (bioluminescence) ، و الکتروکمی لومینسانس (electrochemiluminescence)

کمی لومینسانس ، بیولومینسانس و الکتروکمی لومینسانس گونه هایی از لومینسانس به شمار میروند در که در آنها پدیده تحریک به وسیله 1) واکنش شیمیایی 2) واکنش بیوشیمیایی یا 3) واکنش الکتروشیمیایی ایجاد میشود و نه به وسیله درخشش نوری (photoillumination).

مفهوم های پایه

پدیده فیزیکی گسیل نور در کمی لومینسانس ،بیولومینسانس و الکتروکمی لومینسانس همانند فلورسانس است و گسیل نور در آنها از یک تراز یگانه تحریک شده رخ میدهد و هنگامی که الکترون به تراز پایه خود باز میگردد نور گسیل می یابد.

فسفرسانس (phosphorescence)

فسفرسانس، لومینسانسی است که شماری از مواد مانند سولفید روی (zinc sulfide) پس از جذب انرژی تابشی یا دیگر انرژی ها تولید میکنند.تفاوت فسفرسانس و فلورسانس در این است که گسیل نور در فسفرسانس از بازگشت حالت الکترونیکی سه گانه تحریک شده مولکول به حالت پایه تولید میشود در برابر گسیل نور از حالت یگانه تحریک شده به حالت پایه در فلورسانس.زمان زوال (decay time) گسیل نور فسفرسانس معمولا بیشتر (10^-4  -  10^2 s) زمان زوال گسیل فلورسانس است و این بخاطر طول عمر بیشتر مولکول ها در حالت سه گانه تحریک شده در فسفرسانس است.فسفرسانس یک سوگرایی بیشتری در طول موج گسیل شده در برابر فلورسانس نشان میدهد.

طیف سنجی تابش شعله(flame photometry) و طیف سنجی پلاسمای جفت شده القایی(inductively coupled plasma spectrophotometry)

طیف سنجی تابش شعله (فلیم فتومتری) بر پایه ویژگی های تابش نور توسط اتم های بسیاری از عناصر فی بنا شده است در هنگامی که به آنها انرژی کافی داده شود مانند آنچه که توسط یک شعله داغ تامین میشود. طول موجی که برای اندازه گیری یک عنصر استفاده میشود بستگی به خطی از طول موج دارد که دارای شدت کافی در فراهم کردن حساسیت لازم و عاری بودن از هر گونه خطهای مداخله گر در و یا نزدیک به طول موج انتخاب شده می باشد. 

نور سنجی بازتابش (reflectance photometry)

در نورسنجی بازتابش ، نور بازتاب یافته منتشر شده اندازه گیری میشود.مخلوط واکنش موجود در یک ظرف با نورهای منتشر شده درخشان میشود و شدت نور بازتاب یافته از ماده رنگزا با شدت نور بازتاب یافته از یک سطح مرجع مقایسه میشود.از آنجایی که شدت نور بازتاب یافته با غلظت انالیت یک ارتباط غیر خطی (nonlinear ) دارد از معادله Kubelka-Munk یا تغییر شکل Clapper – Williams معمولا استفاده میشود تا داده ها را به شکل خطی تبدیل کنند (فصل 19 را ببینید).اجزای الکتریکی – نوری استفاده شده در نورسنجی بازتابش در اساس همان است که در نورسنجی بر پایه جذب بکار رفته است به جز اینکه سیستم طوری طراحی شده است که منبع نور و اشکار ساز نزدیک به هم در یک طرف نمونه قرار گرفته اند درست برخلاف فوتومتری جذب که این دو در دو طرف نمونه و در مقابل هم  واقع شده اند.

الکتروفورز (electrophoresis) - بخش سوم

میکروچیپ الکتروفورز (microchip electrophoresis)

طی یک دهه گذشته میکروچیپ الکتروفورز تحول های بنیادینی را به خود دیده است در 1) طراحی های میکروچیپ مجتمع  2) سیستم های آشکار ساز پیش رفته  3) کابردهای جدید. در حوزه تشخیص بالینی ،آنالیتهای عمده مورد جستجو در قالب میکروچیپ پروتیین ها و DNA هستند.

از میان ویژگی های جداسازی با میکروچیپ الکتروفورز میتوان به سرعت بالای آن – به طور طبعی چهار تا ده برابر سریعتر از الکتروفورز مویین معمولی است و حداقل چندین برابر سریعتر از روشهای ژل های ورقه ای (slab gel) است.دیگر برتری های میکروچیپ الکتروفورز شامل 1) سادگی  2) توانایی در مجتمع کردن میکروچیپ ها با چندین عملکرد و  3) توانایی در خودکار شدن آن است.

دستگاهی کردن (instrumentation)

اگرچه در اصول شبیه به همتای الکتروفورز مویین خود است اما از نظر دستگاهی سیستم میکروچیپ از آن متفاوت است.برای نمونه در روش میکروچیپ 1) کانالهای جداسازی  2) کانالهای تزریق نمونه  3) مخزن ها  4) آماده سازی نمونه  و یا 5) ری اکتورهای های پیش یا پس از ستون (precolumn or postcolumn reactors) همه روی یک سطح میکروچیپ با بکارگرفتن فرایندهای فوتولیتوگرافیک ساخته میشوند.طرح T متقاطع (cross-T design) کلاسیک از یک میکروچیپ تک کانال شامل یک کانال (تزریق) کوتاه است که کانال (جداسازی) بلندتر را را قطع میکند و شامل یک مخزن در انتهای هر یک از آنها است که در شکل 12-9 نشان داده شده است.ساختار آشکارسازی بر پایه فلورسانس القایی با لیزر (laser-induced fluorescence=LIF) در یک میکروچیپ تک کانال در شکل 12-10 نشان داده شده است.

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12

کروماتوگرافی و استخراج (chromatography and extraction)

مایع های زیستی مخلوط های پیچیده ای هستند و آزمایشهای بالینی برای اجزای خاصی از این مایع ها اغلب یک یا چند مرحله جداسازی پی در پی را می خواهد تا اجزای مورد نظر جدا یا تغلیظ شوند.روشهای معمول برای دست یافتن برای این جداسازی شامل 1) کروماتوگرافی (chromatography) 2) استخراج (extraction) 3) پرسیپیتاسیون افتراقی (differential precipitation) 4) الکتروفورز (electrophoresis) .این فصل مفاهیم پایه و اصول کروماتوگرافی و استخراج را که به عنوان تکنیکهای آنالیتیکال بکار میروند را توصیف میکند.

کروماتوگرافی (chromatography)

کروماتوگرافی فرایندی است که در آن اجزای یک مخلوط به وسیله توزیع افتراقی (differential distribution) میان فاز متحرک (mobile phase)  و فاز ثابت (stationary phase)، جدا میشوند.